3.5 高效液相色譜測定
3.5.1 HPLC 參考條件
a) 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當者。
b) 流動相：C8柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱溫：40℃。
GB/T 22388—2008
e) 波長：240 nm。
f) 進樣量：20 μL。
3.5.2 標準曲線的繪制
用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。基質匹配加標三聚氰胺的樣品HPLC 色譜圖參見附錄A 中的圖A.1。
3.5.3 定量測定
待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
3.5.4 結果計算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數據處理軟件或按式（1）計算獲得：
A × c × V×1000
X= × f ……………………（1）
As × m×1000
式中：
X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c —— 標準溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V —— 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；
As —— 標準溶液中三聚氰胺的峰面積；
m —— 試樣的質量，單位為克（g）；
f —— 稀釋倍數。
3.6 空白實驗
除不稱取樣品外，均按上述測定條件和步驟進行。
3.7 方法定量限
本方法的定量限為2 mg/kg。
3.8 回收率
在添加濃度2 mg/kg～10 mg/kg濃度范圍內，回收率在80%～110%之間，相對標準偏差小于10%。
3.9 允許差
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
4 第二法液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）
4.1 原理
試樣用三氯乙酸溶液提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質譜/質譜法測定和確證，外標法定量。
GB/T 22388—2008
4.2 試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的一級水。
4.2.1 乙酸。
4.2.2 乙酸銨。
4.2.3 乙酸銨溶液（10 mmol/L）：準確稱取0.772 g 乙酸銨于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，
混勻后備用。
4.2.4 其他同3.2。
4.3 儀器和設備
4.3.1 液相色譜-質譜/質譜（LC-MS/MS）儀：配有電噴霧離子源（ESI）。
4.3.2 其他同3.3。
4.4 樣品處理
4.4.1 提取
4.4.1.1 液態奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和2 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r/min離心10 min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，做待凈化液。
4.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉移至50 mL具塞塑料離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分數次清洗研缽，清洗液轉入離心管中，再加入2mL乙腈，余下操作同4.4.1.1中“超聲提取10 min，……做待凈化液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
4.4.2 凈化
將4.4.1中的待凈化液轉移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物（相當于1 g試樣）用1 mL流動相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜（3.2.16）后，供LC-MS/MS測定。
4.5 液相色譜-質譜/質譜測定
4.5.1 LC 參考條件
a) 色譜柱：強陽離子交換與反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm×2.0 mm（i.d.），5 μm，或相當者。
b) 流動相：等體積的乙酸銨溶液（4.2.3）和乙腈充分混合，用乙酸調節至pH=3.0后備用。
c) 進樣量：10 μL。
d) 柱溫：40℃。
e) 流速：0.2 mL/min。
4.5.2 MS/MS 參考條件
a) 電離方式：電噴霧電離，正離子。
b) 離子噴霧電壓：4 kV。
c) 霧化氣：氮氣，40 psi。
d) 干燥氣：氮氣，流速10 L/min，溫度350℃。
e) 碰撞氣：氮氣。
f) 分辨率：Q1（單位）Q3（單位）。
g) 掃描模式：多反應監測（MRM），母離子m/z 127，定量子離子m/z 85，定性子離子m/z 68。
h) 停留時間：0.3 s。
i) 裂解電壓：100 V。
j) 碰撞能量：m/z 127>85 為20 V，m/z 127>68 為35 V。
4.5.3 標準曲線的繪制
取空白樣品按照4.4 處理。用所得的樣品溶液將三聚氰胺標準儲備液（3.2.12）逐級稀釋得到的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程?；|匹配加標三聚氰胺的樣品LC-MS/MS 多反應監測質量色譜圖參見附錄A 中的圖A.2。
4.5.4 定量測定
待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
4.5.5 定性判定
按照上述條件測定試樣和標準工作溶液，如果試樣中的質量色譜峰保留時間與標準工作溶液一
致（變化范圍在±2.5%之內）；樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表1的規定，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。
表1 定性離子相對豐度的最大允許偏差
相對離子豐度>50% >20%至50% >10%至20% ≤10%
允許的相對偏差±20% ±25% ±30% ±50%
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