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人粒細(xì)胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)全文

2010年09月09日10:25 | 中國(guó)發(fā)展門戶網(wǎng) www.chinagate.cn | 給編輯寫信 字號(hào)：T|T
關(guān)鍵詞： 殺蟲劑 蜱蟲  綜合征 中毒事件 疫情 血小板減少 疑似病例 發(fā)熱 形體 重災(zāi)區(qū) 病原體

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（三）嗜粒細(xì)胞無形體核酸PCR檢測(cè)。

目前，國(guó)際推薦使用16S rRNA基因檢測(cè)方法，有條件的實(shí)驗(yàn)室，可進(jìn)一步選用熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細(xì)胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE緩沖液50μl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細(xì)胞層提取DNA，可明顯提高陽性檢出率。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采集當(dāng)?shù)卣Ｈ搜和瑫r(shí)提取DNA，作為PCR的陰性對(duì)照。

2. PCR擴(kuò)增

（1）16S rRNA基因檢測(cè)：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測(cè)最常用的擴(kuò)增靶基因，巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，避免污染。使用引物序列見表1。

表1  巢式PCR檢測(cè)無形體及埃立克體16S rRNA基因常用引物

引物名稱

序 列

片段長(zhǎng)度(bp)

Eh-out1(AF414399)

5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’

653

Eh-out2(AF414399)

5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’

Eh-gs1(AF414399)

5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’

282

Eh-gs2(AF414399)

5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’

HGA1

5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’

389

HGA2

5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’


PCR反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。第一輪反應(yīng)采用外引物對(duì)Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10μl（白細(xì)胞提取的DNA可適當(dāng)減少）。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl或50μl（需要進(jìn)行PCR測(cè)序或克隆時(shí)，應(yīng)適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系），其它成分的濃度按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：

94℃ 5min

40循環(huán)：94℃ 45sec

55℃ 50sec

72℃ 1min

72℃ 總延伸 5min

第二輪反應(yīng)使用2對(duì)引物分別進(jìn)行巢式PCR。2對(duì)引物分別是無形體屬及埃立克體屬通用內(nèi)引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測(cè)樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽性對(duì)照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。

（2）熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增

與groEL基因的應(yīng)用相比，16S rRNA基因的應(yīng)用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對(duì)于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。該基因擴(kuò)增使用巢式PCR，引物序列見表2。

表2  groEL基因擴(kuò)增常用引物   

引物名稱

序  列

退火溫度

片段長(zhǎng)度bp)

HS1

5’-TGG GCT GGT  A（A/C）TGA AAT

52℃

1431

HS6

5’-CCI CCI GGI ACI  A（C/T）ACC TTC

HS43

5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC

55℃

HGA480

HS45

5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC

HME528


DNA提取同上。PCR檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測(cè)。巢式PCR第一輪反應(yīng)采用外引物對(duì)HS1及HS6。

反應(yīng)程序如下：

3循環(huán)：94℃ 1min

48℃ 2min

70℃ 90sec

37循環(huán)：88℃ 1min

52℃ 2min

70℃ 90sec

68℃ 總延伸 5min

第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測(cè)樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽性對(duì)照取0.5μl為模板。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)。反應(yīng)程序同第一輪反應(yīng)，但退火溫度由52℃改為55℃。

3．測(cè)序及分析

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行同源比較，分析當(dāng)?shù)亓餍兄昱c其它地區(qū)的變異性。

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